中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

WS/T799—2022

污水中新型冠狀病毒富集濃縮和核酸檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)

Methodfor enrichment and nucleic acid detection of SARS-CoV-2 in sewage

2022 -03 - 24 發(fā)布

2022 -03 - 24 實(shí)施

中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布

前言

本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家衛(wèi)生健康委環(huán)境健康標(biāo)準(zhǔn)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)負(fù)責(zé)技術(shù)審查和技術(shù)咨詢(xún)，由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)處負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)性和格式審查，由國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)疾控局負(fù)責(zé)業(yè)務(wù)管理、法規(guī)司負(fù)責(zé)統(tǒng)籌管理。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所、清華大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心、中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：張嵐、唐宋、黃霞、楊敏、張曉、張良、王園媛、劉艷臣、田哲、段招軍。

污水中新型冠狀病毒富集濃縮和核酸檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)

1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了污水中新型冠狀病毒富集濃縮和核酸檢測(cè)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于生活污水、醫(yī)療機(jī)構(gòu)污水中新型冠狀病毒富集濃縮和核酸檢測(cè)。

2 規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本標(biāo)準(zhǔn)必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

WS/T 697 新冠肺炎疫情期間特定人群個(gè)人防護(hù)指南

3 術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

3.1

新型冠狀病毒 severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2

屬于β屬冠狀病毒，基因組為線性單股正鏈的RNA病毒，全長(zhǎng)約30 kb，有包膜，呈圓形或橢圓形顆粒狀，直徑為60 nm～140 nm。

3.2

Ct 值 cycle threshold

在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，每個(gè)反應(yīng)體系中的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

3.3

實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) real-time fluorescent reverse tranion polymerase chainreaction

在反轉(zhuǎn)錄DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的擴(kuò)增反應(yīng)中加入熒光化學(xué)物質(zhì)，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析方法。

4 檢出限

富集濃縮采用聚乙二醇沉淀法或鋁鹽混凝沉淀法時(shí)，方法檢出限為10 copies/mL；富集濃縮采用離心超濾法時(shí)，方法檢出限為100copies/mL。

5 水樣的采集、運(yùn)輸及保存

根據(jù)采樣場(chǎng)所排水系統(tǒng)分布情況，重點(diǎn)選取污水排水口、內(nèi)部管網(wǎng)匯集處等關(guān)鍵位置對(duì)未經(jīng)消殺處理的污水進(jìn)行采樣。用無(wú)菌聚乙烯瓶采集污水樣本，采樣體積為300 mL?？筛鶕?jù)現(xiàn)場(chǎng)條件和檢測(cè)需求確定水樣采集方式，如瞬時(shí)水樣（采樣點(diǎn)位某一時(shí)間隨機(jī)采集的樣本）或混合水樣（同一采樣點(diǎn)位不同時(shí)間所采集的瞬時(shí)水樣混合后的樣本）。樣本采集后應(yīng)在現(xiàn)場(chǎng)使用75 %酒精對(duì)采樣瓶外表面進(jìn)行消毒，然后將采樣瓶裝入密封采樣袋中，對(duì)密封采樣袋外表面再次進(jìn)行消毒，并盡快將樣本送至實(shí)驗(yàn)室，運(yùn)輸過(guò)程中確保0 ℃～4 ℃條件下冷藏運(yùn)輸。到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后樣本同樣應(yīng)保存于0 ℃～4 ℃環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在接到樣本后24 h內(nèi)進(jìn)行富集濃縮處理，并在富集濃縮后24 h內(nèi)完成核酸提取及實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（實(shí)時(shí)熒光RT-PCR）檢測(cè)。

6 病毒滅活

將樣本充分混勻后置于60 ℃水浴30 min。

注：水浴鍋水位應(yīng)高于樣本液面，確保容器內(nèi)樣本達(dá)到目標(biāo)溫度。

7 病毒富集濃縮

注：本部分中三種新型冠狀病毒富集濃縮方法適用條件相同，使用過(guò)程中可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行選擇。

7.1聚乙二醇沉淀法

7.1.1 原理

向污水中加入聚乙二醇，聚乙二醇在一定鹽濃度條件下可使病毒顆粒形成多聚體，在一定離心力下將水溶液與病毒顆粒多聚體分開(kāi)，收集病毒顆粒多聚體形成的沉淀，用于后續(xù)核酸提取和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)。

7.1.2 試劑和材料

7.1.2.1 試劑

7.1.2.1.1 聚乙二醇：分子生物學(xué)級(jí)，平均分子量 8 000。

7.1.2.1.2 氯化鈉：分子生物學(xué)級(jí)。

7.1.2.1.3 無(wú)核酸酶水：分子生物學(xué)級(jí)。

7.1.2.2 材料

7.1.2.2.1 無(wú)菌帶蓋離心管：1.5mL，無(wú)核酸酶；50 mL 或 250 mL，可承受離心力≥12 000 g。

7.1.2.2.2 無(wú)菌移液器吸頭：1 mL，帶濾芯，無(wú)核酸酶。

7.1.2.2.3 無(wú)菌移液管：50 mL。

7.1.3 儀器設(shè)備

7.1.3.1 高速冷凍離心機(jī)：4 ℃，50 mL 或 250 mL 轉(zhuǎn)子，可承受離心力≥12 000 g。

7.1.3.2 電子天平：分辨力不低于 0.001 g。

7.1.3.3 生物安全柜：II 級(jí)或 II 級(jí)以上。

7.1.3.4 高壓滅菌器。

7.1.3.5 移液器：1 mL。

7.1.3.6 大容量電動(dòng)移液器。

7.1.4 富集濃縮步驟

7.1.4.1 預(yù)離心

用大容量電動(dòng)移液器分別移取3份35 mL污水樣本置于3個(gè)50 mL離心管中，在4 ℃、2 500g條件下離心30 min，將上清液分別轉(zhuǎn)移到另外3個(gè)50 mL離心管中備用。剩余污水樣本作為備份。

注1：當(dāng)污水樣本懸浮物含量過(guò)高，可能影響病毒核酸提取和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)時(shí)，應(yīng)采用預(yù)離心棄除懸浮物后再進(jìn)行后續(xù)操作。

注2：若選用250 mL離心管，可直接取105mL污水樣本于250 mL離心管中，在上述條件下離心后將上清液轉(zhuǎn)移到另外1個(gè)250 mL離心管中備用。

7.1.4.2 第二次離心在3個(gè)裝有35 mL污水樣本或預(yù)離心后上清液的50 mL離心管中分別加入3.5 g±0.1 g聚乙二醇和0.79g±0.01 g氯化鈉，充分混合，直至試劑完全溶解，該溶解過(guò)程約需15 min。然后在4 ℃、12 000g條件下離心120 min，離心機(jī)降速時(shí)不應(yīng)使用制動(dòng)力。離心機(jī)停止后傾倒并棄除離心管中的上清液，至無(wú)上清液流出。

注：若選用250 mL離心管，在裝有105 mL污水樣本或預(yù)離心后上清液的250 mL離心管中操作時(shí)，聚乙二醇和氯化鈉用量應(yīng)等比例增加，其他操作相同。

7.1.4.3 富集濃縮

7.1.4.3.1 在 4 ℃、12 000 g 條件下將第二次離心后剩余的樣本再次離心 5 min，離心機(jī)降速時(shí)不應(yīng)使用制動(dòng)力。離心機(jī)停止后用移液器從離心管中吸出并棄除剩余的上清液。

7.1.4.3.2 吸取 0.4 mL 無(wú)核酸酶水加入到其中的一個(gè)離心管中，反復(fù)吹吸沉淀，瞬時(shí)離心，使所有液體聚集在管底，將混懸液吸出并加入到第二個(gè)離心管中。

7.1.4.3.3 重復(fù)吹吸沉淀和瞬時(shí)離心的操作后，再次將混懸液吸出并加入到第三個(gè)離心管中。

7.1.4.3.4 繼續(xù)重復(fù)吹吸沉淀和瞬時(shí)離心的操作，最終形成的混懸液即為該水樣的濃縮液，體積約為0.6 mL。將濃縮液轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 離心管中，于 0 ℃～4 ℃條件下保存，并于 24h 內(nèi)完成核酸提取和實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 檢測(cè)。

注：若選用250 mL離心管，按照7.1.4.3.1條件再次離心并棄除剩余的上清液后，在離心管中加入0.4 mL無(wú)核酸酶水，反復(fù)吹吸沉淀，并瞬時(shí)離心后即得到濃縮液。

7.2鋁鹽混凝沉淀法

7.2.1 原理

向污水中加入鋁鹽混凝劑，鋁鹽水解產(chǎn)生的氫氧化鋁膠體可吸附和包裹病毒顆粒，通過(guò)離心作用收集含病毒的膠體，然后通過(guò)化學(xué)溶解釋放出包裹的病毒顆粒，用于后續(xù)核酸提取和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)。

7.2.2 試劑和材料

7.2.2.1 試劑

7.2.2.1.1 實(shí)驗(yàn)用水：GB/T6682 規(guī)定的一級(jí)水。

7.2.2.1.2 氯化鋁溶液[c（AlCl3）=0.3 mol/L]：稱(chēng)取4 g 無(wú)水氯化鋁（純度≥99 %），置于燒杯中，加入 100mL 水，攪拌溶解后轉(zhuǎn)移至試劑瓶中。

7.2.2.1.3 氫氧化鈉溶液[c（NaOH）=1 mol/L]：稱(chēng)取 4g 氫氧化鈉（純度≥96 %），置于燒杯中，加入100 mL 水，攪拌溶解后轉(zhuǎn)移至試劑瓶中。

7.2.2.1.4 鹽酸溶液[c（HCl）=1 mol/L]：移取 43mL 鹽酸（分析純，ρ20=1.19 g/mL）于燒杯中，加入適量水，用玻璃棒攪拌混勻后轉(zhuǎn)移至 500 mL 容量瓶中，并定容至刻度。

7.2.2.1.5 乙二胺四乙酸二鈉二水合物（C10H14N2O8Na2·2H2O）：純度≥98 %。

7.2.2.2 材料

7.2.2.2.1 無(wú)菌螺口錐形瓶：100mL。

7.2.2.2.2 無(wú)菌帶蓋離心管：10mL、50 mL。

7.2.2.2.3 無(wú)菌移液器吸頭：200 μL、1 mL，帶濾芯，無(wú)核酸酶。

7.2.2.2.4 無(wú)菌移液管：50 mL。

7.2.3 儀器設(shè)備

7.2.3.1 冷凍離心機(jī)：4 ℃，50 mL 轉(zhuǎn)子，可承受離心力≥2 500 g。

7.2.3.2 恒溫振蕩培養(yǎng)箱。

7.2.3.3 電子天平：分辨力不低于 0.001 g。

7.2.3.4 pH 計(jì)：精度≥0.01。

7.2.3.5 水浴鍋。

7.2.3.6 生物安全柜：II 級(jí)或 II 級(jí)以上。

7.2.3.7 高壓滅菌器。

7.2.3.8 移液器：200 μL、1 mL。

7.2.3.9 大容量電動(dòng)移液器。

7.2.4 富集濃縮步驟

7.2.4.1 預(yù)離心

取大于50 mL的污水樣本在4 ℃、2 500g條件下離心30 min，留取上清液備用。剩余污水樣本作為備份。

注：當(dāng)污水樣本懸浮物含量過(guò)高，可能影響病毒核酸提取和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)時(shí)，應(yīng)采用預(yù)離心棄除懸浮物后再進(jìn)行后續(xù)操作。

7.2.4.2 富集濃縮

7.2.4.2.1 絮凝處理

用大容量電動(dòng)移液器將50 mL污水樣本或預(yù)離心后的上清液轉(zhuǎn)移至100 mL螺口錐形瓶中，加入0.5 mL 0.3 mol/L的氯化鋁溶液，用1 mol/L氫氧化鈉溶液或1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)水樣pH=6.0±0.1。將螺口錐形瓶蓋擰緊，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，以150 r/min的速度在室溫下混合15 min。

7.2.4.2.2 離心分離

將水樣轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，在4 ℃、1 900g條件下離心5 min。

7.2.4.2.3 絡(luò)合溶解

傾倒棄除離心管中的上清液，在剩余膠體中加入0.20 g±0.01 g乙二胺四乙酸二鈉二水合物，搖晃數(shù)十次至膠體變?yōu)橐簯B(tài)，轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中。將10 mL離心管置于水浴鍋中，60 ℃水浴10 min。水浴后離心管中的液體即為該水樣的濃縮液，體積約為1 mL，于0 ℃～4 ℃條件下保存，并于24 h內(nèi)完成核酸提取和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)。

7.3離心超濾法

7.3.1 原理

選用嵌有超濾膜的超濾杯，通過(guò)離心作用將分子量大于超濾膜截留分子量的病毒顆粒截留在超濾杯內(nèi)，收集超濾杯中的病毒濃縮液，用于后續(xù)核酸提取和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)。

7.3.2 材料

7.3.2.1 一次性超濾杯：截留分子量為 30 kDa，體積為 70 mL，可倒置離心回收樣本。

7.3.2.2 無(wú)菌帶蓋離心管：2 mL，無(wú)核酸酶；50 mL。

7.3.2.3 無(wú)菌移液器吸頭：1 mL，帶濾芯，無(wú)核酸酶。

7.3.2.4 無(wú)菌移液管：50 mL。

7.3.3 儀器和設(shè)備

7.3.3.1 冷凍離心機(jī)：4 ℃，50 mL 轉(zhuǎn)子，可承受離心力≥6 000 g。

7.3.3.2 冷凍離心機(jī)：4 ℃，250 mL 水平轉(zhuǎn)子，可承受離心力≥3 000 g。

7.3.3.3 生物安全柜：II 級(jí)或 II 級(jí)以上。

7.3.3.4 高壓滅菌器。

7.3.3.5 移液器：1 mL。

7.3.3.6 大容量電動(dòng)移液器。

7.3.4 富集濃縮步驟

7.3.4.1 預(yù)離心

7.3.4.1.1 用大容量電動(dòng)移液器移取50 mL 污水樣本于 50 mL 離心管中，在 4 ℃、5 000 g 條件下離心30 min，分別保留上清液和沉淀物。剩余污水樣本作為備份。

7.3.4.1.2 取 0.5 mL 上清液加入到保留沉淀物的離心管中，將沉淀物重懸混勻，保留待用。

7.3.4.2 富集濃縮

7.3.4.2.1 超濾杯前處理：取 30mL 無(wú)菌水加入到樣品濃縮杯中，使用水平轉(zhuǎn)子在 4 ℃、2480 g 條件下離心 10 min，棄除濾液收集杯中的濾出液，再將樣品濃縮杯反向倒置在濃縮液收集杯上，在 4 ℃、920 g 條件下離心 3min，棄除收集液。

7.3.4.2.2 將 7.3.4.1.1 預(yù)離心得到的上清液轉(zhuǎn)移至樣品濃縮杯中，使用水平轉(zhuǎn)子在 4 ℃、2 480 g 條件下離心15 min。如樣品濃縮杯中殘留液體體積較大，可適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間，直至濃縮杯中液體約為 0.3 mL～0.6 mL。

7.3.4.2.3 待全部上清液濃縮完成后，將樣品濃縮杯反向倒置在濃縮液收集杯上，在 4 ℃、920 g 條件下離心 3min，吸取濃縮液收集杯中的液體，轉(zhuǎn)移至 2 mL 離心管中。

7.3.4.2.4 吸取 7.3.4.1.2預(yù)離心得到的沉淀物混懸液 0.5 mL，與 7.3.4.2.3中得到的液體混合，即為該水樣的濃縮液，體積約為 0.8 mL～1.1mL，于 0 ℃～4 ℃條件下保存，并于 24 h 內(nèi)完成核酸提取和實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 檢測(cè)。

注1：也可選用截留分子量為100 kDa的超濾杯，但對(duì)應(yīng)離心濃縮時(shí)離心力不宜超過(guò)3 000 g；

注2：也可選用不帶倒置離心功能的超濾杯，但在完成7.3.4.2.2后，7.3.4.2.3應(yīng)改為“待全部上清液濃縮完成后，取下樣品濃縮杯，用移液器吸取濃縮液體小心吹打膜數(shù)次后，吸取所有濃縮液并轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中”。

8 核酸檢測(cè)

8.1核酸提取

8.1.1 試劑和材料

8.1.1.1 試劑

8.1.1.1.1 病毒核酸提取試劑盒。

8.1.1.1.2 無(wú)核酸酶水：分子生物學(xué)級(jí)。

8.1.1.2 材料

8.1.1.2.1 無(wú)菌帶蓋離心管：1.5mL，無(wú)核酸酶。

8.1.1.2.2 無(wú)菌移液器吸頭：10 μL、200 μL、1 mL，帶濾芯，無(wú)核酸酶。

注：其他材料參照所用病毒核酸提取試劑盒。

8.1.2 儀器和設(shè)備

8.1.2.1 生物安全柜：II 級(jí)或 II 級(jí)以上。

8.1.2.2 高壓滅菌器。

8.1.2.3 移液器：10 μL、200 μL、1 mL。

注：其他儀器和設(shè)備參照所用病毒核酸提取試劑盒。

8.1.3 核酸提取步驟

在生物安全柜中打開(kāi)裝有污水樣本濃縮液的離心管，按照病毒核酸提取試劑盒說(shuō)明，取適量濃縮液進(jìn)行核酸提取，提取完成后應(yīng)立即封蓋并馬上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)。剩余的濃縮液和核酸樣本應(yīng)于-80 ℃條件下凍存。

實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 檢測(cè)

8.2.1 試劑和材料

8.2.1.1 試劑

8.2.1.1.1 新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒（熒光 PCR 法）。

8.2.1.1.2 無(wú)核酸酶水：分子生物學(xué)級(jí)。

8.2.1.2 材料

8.2.1.2.1 無(wú)菌移液器吸頭：10 μL、100 μL、200 μL、1 mL，帶濾芯，無(wú)核酸酶。

8.2.1.2.2 無(wú)菌 PCR 管或 PCR 板：無(wú)核酸酶。

8.2.2 儀器和設(shè)備

8.2.2.1 實(shí)時(shí)熒光 PCR 儀。

8.2.2.2 混勻器。

8.2.2.3 生物安全柜：II 級(jí)或 II 級(jí)以上。

8.2.2.4 移液器：10 μL、100 μL、200 μL、1 mL。

注：其他儀器和設(shè)備參照所用新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒。

8.2.3 檢測(cè)步驟

8.2.3.1 檢測(cè)靶標(biāo)選擇原則

采用雙靶標(biāo)檢測(cè)，針對(duì)開(kāi)放讀碼框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核殼蛋白（nucleocapsid protein，N）。必要時(shí)可根據(jù)檢測(cè)需求和相關(guān)規(guī)定進(jìn)行調(diào)整。

8.2.3.2 反應(yīng)體系

參照新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行。

9 質(zhì)量控制

9.1富集濃縮質(zhì)量控制

9.1.1 富集濃縮陽(yáng)性質(zhì)量控制

9.1.1.1 將采集到的污水樣本滅活后，加入污水中不存在的非人源病毒（如：鼠肝炎病毒、牛冠狀病毒、牛呼吸道合胞病毒、新型冠狀病毒假病毒等陽(yáng)性質(zhì)控），加標(biāo)濃度為 1 000 copies/mL，作為富集濃縮陽(yáng)性質(zhì)控樣。富集濃縮陽(yáng)性質(zhì)控樣檢測(cè)過(guò)程與污水樣本檢測(cè)過(guò)程完全相同，但實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 時(shí)應(yīng)使用相應(yīng)核酸檢測(cè)試劑盒。

9.1.1.2 在每一批次檢測(cè)中應(yīng)至少做一個(gè)富集濃縮陽(yáng)性質(zhì)控樣。

9.1.2 富集濃縮陰性質(zhì)量控制

9.1.2.1 樣本采集時(shí)用無(wú)核酸酶水代替污水樣本，將其作為富集濃縮陰性質(zhì)控樣。富集濃縮陰性質(zhì)控樣檢測(cè)過(guò)程與污水樣本檢測(cè)過(guò)程完全相同。

注：富集濃縮陰性質(zhì)控樣同時(shí)也是采樣過(guò)程空白對(duì)照樣。

9.1.2.2 在每一批次檢測(cè)中應(yīng)至少做一個(gè)富集濃縮陰性質(zhì)控樣。

9.2核酸提取質(zhì)量控制

9.2.1 核酸提取陽(yáng)性質(zhì)量控制

9.2.1.1 使用 9.1.1.1 中陽(yáng)性質(zhì)控作為核酸提取過(guò)程陽(yáng)性質(zhì)控樣。核酸提取陽(yáng)性質(zhì)控樣檢測(cè)過(guò)程與污水樣本從核酸提取開(kāi)始的檢測(cè)過(guò)程完全相同，但實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 時(shí)應(yīng)使用相應(yīng)核酸檢測(cè)試劑盒。

9.2.1.2 在每一批次核酸提取過(guò)程中應(yīng)至少做一個(gè)核酸提取陽(yáng)性質(zhì)控樣。

9.2.2 核酸提取陰性質(zhì)量控制

9.2.2.1 使用無(wú)核酸酶水作為核酸提取過(guò)程陰性質(zhì)控樣。核酸提取陰性質(zhì)控樣檢測(cè)過(guò)程與污水樣本從核酸提取開(kāi)始的檢測(cè)過(guò)程完全相同。

9.2.2.2 在每一批次核酸提取過(guò)程中應(yīng)至少做一個(gè)核酸提取陰性質(zhì)控樣。

9.3PCR檢測(cè)質(zhì)量控制

9.3.1 PCR 檢測(cè)陽(yáng)性質(zhì)量控制

9.3.1.1 使用新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒中的陽(yáng)性質(zhì)控作為PCR 檢測(cè)過(guò)程陽(yáng)性質(zhì)控樣。制備反應(yīng)體系時(shí)用 PCR 陽(yáng)性質(zhì)控樣代替樣本核酸加入，其他操作與污水樣本 PCR 檢測(cè)過(guò)程完全相同。

9.3.1.2 在每一批次實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 過(guò)程中應(yīng)至少做一個(gè) PCR 檢測(cè)陽(yáng)性質(zhì)控樣。

9.3.2 PCR 檢測(cè)陰性質(zhì)量控制

9.3.2.1 使用新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒中的陰性質(zhì)控作為PCR 檢測(cè)過(guò)程陰性質(zhì)控樣。制備反應(yīng)體系時(shí)用 PCR 陰性質(zhì)控樣代替樣本核酸加入，其他操作與污水樣本 PCR 檢測(cè)過(guò)程完全相同。

9.3.2.2 在每一批次實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 過(guò)程中應(yīng)至少做一個(gè) PCR 檢測(cè)陰性質(zhì)控樣。

10 結(jié)果與報(bào)告

10.1實(shí)驗(yàn)有效性判斷

實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)滿足表1要求，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。

表1 實(shí)驗(yàn)有效性判斷標(biāo)準(zhǔn)

10.2結(jié)果判定

10.2.1 PCR 結(jié)果判斷

10.2.1.1 陰性：無(wú) Ct 值、無(wú) S 形擴(kuò)增曲線。

10.2.1.2 陽(yáng)性：Ct 值小于或等于新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)規(guī)定值，且有 S 形擴(kuò)增曲線。

注：或以產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。

10.2.2 陽(yáng)性樣本判斷

10.2.2.1 雙靶標(biāo)：同一份樣本中新型冠狀病毒 2 個(gè)靶標(biāo)（ORF1ab 和 N）實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 均出現(xiàn)陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果，即 2 個(gè)靶標(biāo)的 3 個(gè)平行樣各出現(xiàn)至少 1 個(gè)陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果，樣本判定為陽(yáng)性，例如：ORF1ab +/-/-，N -/+/-。

10.2.2.2 單靶標(biāo)：同一份樣本中新型冠狀病毒單靶標(biāo)（ORF1ab 或 N）實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 至少 2 個(gè)平行樣出現(xiàn)陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果，樣本判定為陽(yáng)性，例如：ORF1ab +/+/-，N -/-/-或 ORF1ab -/-/-，N +/+/-。

當(dāng)出現(xiàn)單個(gè)靶標(biāo)只有 1 個(gè)平行樣為陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果時(shí)，需對(duì)該樣本重新進(jìn)行富集濃縮和核酸提取，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)，若仍出現(xiàn)陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果，則樣本判定為陽(yáng)性。

10.3結(jié)果報(bào)告

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，報(bào)告“檢出新型冠狀病毒核酸”或“未檢出新型冠狀病毒核酸”。

11 實(shí)驗(yàn)室安全

11.1生物安全

污水樣本采集時(shí)個(gè)人防護(hù)要求應(yīng)符合WS/T 697相關(guān)規(guī)定。樣本滅活、檢測(cè)等操作應(yīng)在生物安全二級(jí)及以上實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，同時(shí)采用不低于生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的個(gè)人防護(hù)。水樣采集后，富集濃縮、核酸提取和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)等所有操作均應(yīng)避免樣本暴露于外環(huán)境。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生的所有廢棄物（包括剩余水樣）均應(yīng)經(jīng)有效滅菌后再按醫(yī)療廢棄物進(jìn)行分類(lèi)處理。

11.2實(shí)驗(yàn)室設(shè)備使用安全

離心機(jī)應(yīng)裝有不平衡振動(dòng)顯示及報(bào)警裝置。